肠杆菌和其它非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）20E是经典的微量生化鉴定系统，广泛用于临床、食品、环境及科研实验室对肠杆菌科及部分非苛养革兰氏阴性杆菌的表型鉴定。该系统基于20项生化反应的比色或荧光变化，通过数值编码与数据库比对实现菌种识别。为确保鉴定结果的准确性与可重复性，严格遵循标准化操作流程。
一、实验前准备
1. 菌株要求：待测菌应为纯培养、18–24小时新鲜培养物，生长于非选择性培养基（如血琼脂或麦康凯平板），且为革兰氏阴性杆菌。
2. 试剂与耗材：确认API 20E试剂条在有效期内，储存于2–8°C；准备0.85%无菌NaCl溶液、矿物油（用于需厌氧反应的孔位）及比色卡。
3. 菌液标准化：用无菌生理盐水或专用悬浮液制备菌悬液，调整至0.5 McFarland浊度标准。此浓度是保证反应灵敏度与特异性的关键，过高或过低均会导致假阳性或假阴性。
二、加样与孵育
1. 加样操作：
使用接种针或微量移液器，将菌悬液依次注入20个微孔，每孔加满，避免气泡产生。
第21孔（通常为空白对照或用于后续补充试验，不加菌液。
2. 矿物油覆盖：
对需厌氧环境的生化反应孔，需在加样后覆盖1–2滴无菌矿物油（约50 μL），以隔绝氧气，促进脱羧酶或硫化氢反应。具体需加油孔位详见说明书（通常为孔1–7中的部分孔）。
3. 孵育条件：
将试剂条置于35±2°C恒温培养箱中孵育18–24小时。不可缩短时间（反应未完成）或延长超过24小时（可能导致非特异性反应）。
三、结果判读与编码
1. 显色判读：
孵育结束后，逐孔观察颜色变化。多数反应通过pH指示剂显色（如黄色=阳性，蓝色/绿色=阴性）；H₂S反应通过黑色沉淀判断；IND孔需加入1滴API IND试剂（对二甲氨基苯甲醛）后观察红色环（阳性）。
2. 数值编码：
将20项结果按3-3-3-3-3-3-2分组（共7组），每组阳性反应赋值，相加得组值，形成7位数字编码。
3. 数据库比对：
通过在线系统或配套软件输入编码，获取鉴定结果（包括菌种名称、T指数/T%值）。
四、质量控制与注意事项
避免交叉污染：每测试一株菌更换吸头或接种环。
不可重复使用：试剂条为一次性设计，禁止部分使用或保存再用。
结果时效性：应在孵育结束后2小时内完成判读，久置可能导致颜色褪变。
结语
肠杆菌和其它非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）20E作为经典的表型鉴定工具，其操作虽看似简单，但每一步均影响鉴定准确性。只有严格遵循标准化流程，注重菌液浓度、孵育时间、显色判读等细节，并结合质控与数据库更新，才能充分发挥其在革兰氏阴性杆菌鉴定中的价值。
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